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病毒濃縮 | Amicon® Ultra超濾管應用方案
更新時間：2024-01-04 瀏覽次數：872
基因(yin)治療(liao)是通過(guo)將特(te)定(ding)的(de)(de)細胞功能改變的(de)(de)遺(yi)傳物質引入患者來(lai)治療(liao)遺(yi)傳疾病。根據給藥的(de)(de)方式可以分為：體內基因(yin)治療(liao)（invivo）和體外基因(yin)治療(liao)（invitro）。
體內基因治(zhi)(zhi)療指(zhi)將攜帶治(zhi)(zhi)療性轉基因的載(zai)體直接注(zhu)入患者(zhe)體內。
體外基(ji)因治(zhi)療包(bao)括(kuo)從患者的細(xi)(xi)胞或異體來源提(ti)取細(xi)(xi)胞，通過攜帶(dai)治(zhi)療性轉基(ji)因的載體進行(xing)基(ji)因修(xiu)飾，再(zai)將(jiang)該工程細(xi)(xi)胞重新(xin)導入患者體內(nei)。
基因治療的(de)關(guan)鍵(jian)步驟是如何有效地通過遞(di)送載體(ti)將基因傳遞(di)到目標組織/細胞。根(gen)據(ju)載體(ti)的(de)屬(shu)性分為：病毒類遞(di)送載體(ti)和非病毒類遞(di)送載體(ti)。不同細胞類型的(de)轉染效率差異很大。因此(ci)，已經開發(fa)了多種病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)來源(yuan)的(de)載體系統(tong)(tong)，用(yong)于改善哺乳動(dong)物細(xi)胞中的(de)cDNA轉(zhuan)(zhuan)導、表達(da)和篩選。這些系統(tong)(tong)包括COS細(xi)胞中的(de)猿病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)40復制子(SV40)以及源(yuan)自(zi)逆轉(zhuan)(zhuan)錄病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)、桿狀(zhuang)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)、甲(jia)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)、人(ren)類免疫(yi)缺陷病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)、牛(niu)痘病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)、腺病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)和腺相(xiang)關病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)（AAV）的(de)cDNA克(ke)隆和表達(da)載體。以逆轉(zhuan)(zhuan)錄病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)、腺病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(Ads)或(huo)腺相(xiang)關病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(AAVs)的(de)使(shi)用(yong)最為(wei)廣(guang)泛。
在臨床(chuang)試驗中使(shi)用病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體相(xiang)關的(de)挑(tiao)戰(zhan)包(bao)括(kuo)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)足夠數量的(de)臨床(chuang)級材料和(he)(he)維(wei)持病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)物安(an)全性。病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)和(he)(he)純化在方(fang)法和(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)產(chan)量和(he)(he)質量方(fang)面各不相(xiang)同。病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)和(he)(he)純化是勞動密集型的(de)且(qie)昂貴的(de)，并(bing)且(qie)可能需要特殊設備（如超(chao)速離(li)心機）。純化腺病(bing)毒、慢(man)病(bing)毒和AAV的(de)(de)標(biao)準方(fang)法是(shi)使用密度(du)(du)梯度(du)(du)超速離心，然后進行長時間透析。近年(nian)來柱或膜層析已成為腺病(bing)毒(du)純化的(de)(de)方(fang)法。病(bing)毒(du)的(de)(de)產(chan)量(liang)通(tong)(tong)(tong)常通(tong)(tong)(tong)過空斑試驗、TCID50測(ce)定和ELISA來確定。對(dui)于大多數(shu)應用，重組病(bing)毒(du)必須純化至高滴(di)度(du)(du)。為了獲得高滴(di)度(du)(du)原液，通(tong)(tong)(tong)常需(xu)要濃縮純化的(de)(de)病(bing)毒(du)顆粒。
之前我們有文章介紹了使用默克Amicon®Ultra超濾管分離提取外泌體，今天給大家介紹超濾管的其它應用-濃縮病毒！下面介紹使用Amicon®Ultra離心超濾裝置濃縮三種常見的病毒類型：慢病毒，腺病毒和腺相關病毒（AAV）。
宿主細胞鋪板(ban)以達到80-85%的匯(hui)合度。
細胞轉染(ran)(ran)重組(zu)質粒(li)或感染(ran)(ran)活病毒顆粒(li)。
根據病(bing)毒(du)的不同，使用(yong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)上清液或沉淀細(xi)(xi)胞(bao)(bao)或兩者兼而有之來純化重組病(bing)毒(du)粒子。通常應用(yong)三到四輪(lun)凍融循(xun)環從細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中釋放病(bing)毒(du)。然后通過離(li)心或預過濾(lv)將細(xi)(xi)胞(bao)(bao)碎片與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)裂解物分(fen)離(li)。
通過密(mi)度梯(ti)度超速離心(xin)或(huo)柱/膜層析從細胞裂解物中純化病毒。在某些情況下可以使用肝素或粘蛋白瓊脂糖的親和色譜。然后將純化的病毒溶液通過透析或滲濾完成將緩沖液置換成適當的儲存溶液。
為了獲得高滴度的病毒原液，可以使用離心超濾濃縮純化的病毒。
備(bei)注：正確選擇設備(bei)、膜(mo)材料、MWCO、離心速度、離心時間和緩沖液組成(cheng)對于感(gan)染性(xing)病毒顆粒的高回收率至(zhi)關重(zhong)要。
Amicon®Ultra超濾管采用50KDa NMWL Ultracel® 再生纖維素膜，已被證明可以成功濃縮腺病毒和AAV溶液。對于慢病毒濃度，可以使用50KDa和100kDa膜的超濾管。
下表顯示了粗制(zhi)細胞裂(lie)解物和(he)色譜純化的(de)(de)病(bing)(bing)毒中腺(xian)病(bing)(bing)毒、慢病(bing)(bing)毒和(he)AAV濃度的(de)(de)典型結果。
表1：采用Millipore®超濾產品濃縮病毒
①我們不建議將病毒濃縮到超過1013顆粒/mL的濃度，以避免可能出現的病毒聚集。
②大多數病毒不能有效地濃縮(suo)并(bing)儲(chu)存(cun)在低鹽緩(huan)沖液中。病毒在濃度為(wei)<250mM鹽濃度的溶液中離心將導致病毒聚集和傳染性降低。推薦儲存溶液配方是：20mMTris、pH8.0、250mMNaCl、5%山梨糖(tang)醇和(he)0.001%PF68（多聚糖(tang)酸）。
濃縮的病(bing)毒原液也(ye)可以通過0.22μm過濾器進行過濾滅菌。例如，無菌Steriflip-GP®過濾裝置（目錄號SCGP00525）可用于50mL或以下的體積或Ultrafree®MCGV（目錄號UFC30GV0S）可用于體積<0.5mL的樣品。對于較大體積的樣品，則可使用70%消毒處理過的Amicon®Ultra或Centricon®Plus70超濾管濃縮。
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